采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被(sLAG 3)抗体的包被微孔中，依次
加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻-底洗涤。用底物TMB显色，TMB在化物酶的催化下转化成蓝
色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中sLAG 3)呈正相关。用酶标仪在450m波长
样品收集、处理及保存方法
1.样本不能含叠氮钠(NaN3),因为叠氮钠(NaN3)是辣根化物酶(HRP)的剂。
2.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行。
3.植物萃取液或其它相关样本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测。
4.保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分
解冻。
自备物品：
仪器:分析天平、离心机、荧光 PCR 扩增仪、组织研磨器、-20 ℃冰箱、可调移液器(2 μL、20μL、200 μL、1000 μL)。
耗材:荧光 PCR 专用反应管、眼科剪、眼科镊、生理盐水、1.5 mL 经焦碳酸酯(DEPC)水处理的离心管、吸头(10 μL、200 μL、1000 μL)、双蒸水。
操作注意事项：


（酶联免疫吸附测定）的基本使用方式可以概括为以下几个步骤：
样品准备与检测步骤
一、样品准备
收集样本
收集样本，如血液、组织、细胞培养上清液等。
按照试剂盒的指示处理样本，如离心、过滤、稀释或沉淀。
二、标准曲线
准备标准品
按照试剂盒提供的浓度梯度稀释标准溶液。
在微孔板的多个孔中加载标准品，通常是双倍稀释系列。
三、预包被
预包被
微孔板通常预先包被有特抗体，用于捕捉待测物质。
四、样品加载
样品加载
在微孔板的孔中加载样品和空白对照。
五、封闭
封闭
可能需要添加封闭剂以减少非特结合。
六、次孵育
次孵育
将微孔板在室温或37°C下孵育一段时间，让待测物质与包被抗体结合。
七、次洗涤
次洗涤
清洗微孔板以去除未结合的物质。
八、添加酶标记的抗体
添加酶标记的抗体
加入酶标记的抗体，它可以与步结合的抗原结合（在竞争法ELISA中，这可能是针对同一抗原的抗体）。
九、第二次孵育
第二次孵育
让酶标记的抗体与抗原结合。
十、第二次洗涤
第二次洗涤
清洗微孔板以去除未结合的酶标记抗体。
十一、添加底物溶液
添加底物溶液
加入底物，底物在酶的作用下会发生颜色变化。
十二、第三次孵育
第三次孵育
允许颜色发展到稳定的程度，时间根据试剂盒说明确定。
十三、终止反应
终止反应
加入终止液，停止颜色变化并稳定结果。
十四、读取吸光度
读取吸光度
使用酶标仪在特定波长（通常450nm，有时405nm或630nm）下读取吸光度。
十五、数据分析
数据分析。

20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。
洗板方法：
1.手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置1mi后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板5次。
2.自动洗板机：每孔注入洗液350μL,浸泡1min,洗板5次。
操作步紧：
1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL;
3.样本孔先加待测样本10μL,再加样本稀释液40μL;空白孔不加。
4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加人辣根化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔，37℃水浴
锅或恒温箱温育60min。
5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1in,甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50uL,37℃避光孵育15min。
7.每孔加入终止液50μL,15min内，在450nm波长处测定各孔的0D值。
结果判断
绘制标准曲线：在Ec工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应0D值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算
各样本浓度值。
试剂盒性能：

安全性
1)避免直接接触停止液和底物A、B。一旦接触到这些液体,请赶快用水冲刷。
2)实验中不要吃喝、抽烟或运用化妆品。
3)不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。
1.准确性：标准品线性回归与预期浓度相关系数R值，大于等于0.9900。
2.灵敏度：最-低检测浓度小于1.0ng儿。
3.特：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
4.重复性：板内、板间变异系数均小于15%。
5.贮藏：2-8℃，避光防潮保存。
6.有效期：6个月